徕卡显微镜：荧光显微镜发光的基本原理
有很多自然界中的发光过程。发光是一个总称，这些类型的发光的事件是没有结果的高温。这篇文章描述了不同形式的发光和荧光的情况下进入细节。相关的技术术语描述荧光，就像淬灭，漂白或量子产率，说明在第二部分的文章给予详细的洞察荧光分子的基本特征
发光过程
一些共同的生物学或生物化学实验室方法是基于几个“... escences”，如磷光，化学发光，生物发光和最后荧光的存在。荧光蛋白作为一个引进的话题，它可能是非常有用的学习多一点“... escences”。这些现象的起源在于拉丁词见：escentia，这已经意味着我们的视觉系统的连接。所有“... escences”描述，我们可以用我们的眼睛感知的物理，化学或生物过程。我们添加后缀“...... escence”词汇的变化，行动或过程像字疗养。
所以，很显然，荧光的东西，我们可以看到，一些涉及变化或过程。我们将学习如何荧光满足这些条件后。首先，我们将采取短期看看其他“... escences”，这是所有luminescences本身发光发光，这不是一个高温的影响是通用的术语。因此，发光可以决定作为一个外表冰冷的身体辐射。这种辐射可以是化学反应或亚原子运动或在晶体上的应力的一个原因。作为结果的热量的物质（例如，热金属）所发出的光，以产生发射的另一种方法是白热。
化学发光的发光过程中的化学反应的基础上，该产品具有的激发中间体。这中间落入地面状态时，发光。不同于荧光，化学发光材料中的电子被激发，通过化学反应，而不是由光子的吸收。化学发光认定其技术应用在例如荧光棒。一个众所周知的化学发光物质是鲁米诺，它是用来在刑事找到血液的痕迹。在这里为Fe 2 +离子，它是存在于血红蛋白作为催化剂的功能，使鲁米诺发光配置。
如果一个生物体发光的，我们讲的生物发光，不管如何产生光。有很多生物体产生光，就像萤火虫（夜光Lampyris）或萤火虫（北美产萤火虫）。其他几种真菌在一排是一个非常特殊的有机体的的杰克O'Lantern蘑菇（Omphalotus nidiformis），在黑暗中发光。大量的海洋生物，如一些珊瑚，藻类，crustacaea，甚至鱿鱼发光，大多是在蓝色或绿色的频谱。海居民Aequorea victoria的水母bioluminating 源的绿色荧光蛋白（GFP）。而萤火虫，例如只使用一个化学过程，产生光，A. 维多利亚使用化学发光和荧光过程。科学家发现，水母蛋白水母发光蛋白的帮助下，通过化学反应产生蓝色光。然后，使用该蓝色光激发绿色发光荧光反应导致已经提到的绿色荧光蛋白在。
这使我们的问题是：“什么是荧光？” 荧光物质发光波长较短的光的吸收的效果是一个过程。波长的差异被称为斯托克的移位。详细地说，如果发生荧光的物质吸收光的光子的形式。这导致了电子的偏移到更高的能级。但这种高能量的情况很不稳定，这就是为什么电子倾向于返回到基态。在此过程中的能量，可以被看作是一个发光的光子的形式再次释放。磷光相比，电子能量转移是非常快的，事实上，在纳米秒的范围内（第1图）。能拥有一种不同的发光波长与另一种不同的波长激发后的任何物质，这是被称为荧光染料。在下一节中讨论了这些问题。最受欢迎的发荧光的物质，存在于自然界中有广泛的激发和发射光谱，但具有明确定义的最大激发和发射的物质是更加有用的荧光显微镜。 类似的荧光，磷光与光激发磷光材料的发光的现象。即使它是密切相关的荧光，它是慢得多。荧光相反减速的再次发射的光子激发的电子能量由协会与“禁止”状态。不会发生荧光的情况下尽可能快，因为他们返回到基态能量被“困”。磷光材料的典型例子是“辉光在这黑暗的”可以“充电”与普通灯泡或日光，然后发光几分钟甚至几小时的玩具。 图 1：荧光雅布隆斯基图的 如上面已经提到，荧光染料是任何能够发出荧光的物质。在我们的例子中，荧光蛋白是一种荧光染料。在进入细节之前，我们将介绍一些词汇及用语描述一种荧光蛋白。一个字的使用非常频繁，在与荧光荧光：荧光分子（如蛋白质）的那部分，这是负责其能力荧光。因此，GFP或其衍生物GFP或其衍生物与任何杂合蛋白的荧光基团（例如，α-微管蛋白-GFP）。但是，不具有荧光团是一种蛋白质。FITC，TRITC（20个原子）量子点（100-100,000原子）等小分子，如荧光基团。 寻找稍微深一点到荧光团中，我们到达的发色团，它是一种分子，它的颜色定义（第2图）的部分。内的发色基团，电子和互连的发光（见上文）的能量电平转换发生。有至少两种形式的发色基团。或者为它们的共轭π电子共振系统（GFP），或金属配合物（叶绿素，血红素）构建。 由于其相关的显微镜，我们将采取仔细看看GFP生色。事实证明GFP的发色团的形成没有其他的辅助因子或酶组分比分子氧是必要的。定义的绿色荧光蛋白的氨基酸主链的一级结构，自发形成中的自催化的折叠机构，并通过分子内重排完成。进入的细节，发色基团是由三个相关的氨基酸Ser65，Tyr66，Gly67依次进行的环化，脱水和氧化。这些反应的结果是一个共轭的π-电子的谐振系统，成熟的绿色荧光蛋白发色团。 寻找上面的整个GFP结构，环状三肽坐落在中间的气缸。该筒体是由11股线形成的β-桶结构，使蛋白质高的稳定性。β桶结构具有的直径为3nm左右，高度为约4nm（第3图）。到目前为止已知的所有的FPS有这样的保护筒光物理性质上有很大的影响。在绿色荧光蛋白基因的情况下，量子产率和光稳定性也比较高。此外，非常紧凑的蛋白质结构导致的高pH电阻。用GFP标记的样品是相对稳健的温度和高耐受性物质，如多聚甲醛，尿素或盐酸胍变性。 图 2：层次荧光蛋白 图3：绿色荧光蛋白（GFP）的分子结构 尽管如此，还是有一定的局限和限制应在下一节中提到的FPS。淬灭的过程中，例如，荧光团的强度，以可逆的方式降低。这种衰变的原因有多种。一方面，有可能是一个复合物的形成或一个内部转换。另一方面淬灭可以是能量传递过程的效果。称为FRET显微应用需要利用这个程序。在福斯特共振能量转移或荧光共振能量转移到受体荧光A.荧光的D降低，而A增加的荧光，能量转移的供体荧光ð。 淬灭是一个可逆的过程相反，是一种不可逆的荧光下降过程被称为漂白。永久荧光损失是基于长时间暴露在激发光的荧光破坏。漂白的量依赖于光源的强度，照射时间和能量。每个荧光漂白剂之前有一定的激发和发射周期。在GFP的情况下，每个分子可兴奋约10 4 -10 5倍。符合0.1-1小号。 使用共聚焦激光扫描显微镜的光强度约为10 6 W /米2是常见的。这种高能剂量提供光子过量导致的现象，很多荧光分子的激发状态。在这种情况下，他们不再在其通常的波长吸收光。有了它，有效的染料浓度的减少，或者换句话说，在显示器上示出的像素是不再染料浓度的直接函数。与此相反，以用一个简单的弧灯的照明，可以使用高能量的激光的激发和发射之间的一种非线性的关系。 谈到荧光蛋白的效率，我们应该提到的量子产率。这是另一种荧光团的特征相比，光子的输入和输出。对于某些荧光量子产率计算，除以发射光子吸收的 亮度的荧光蛋白是应用荧光显微镜时要考虑的另一个重要特点。根据显微镜的质量参数是在一个实验的成功的一个关键点。一种客观的方式来指定一种荧光蛋白的亮度是其摩尔消光系数的乘法运算，其量子产率除以1,000。摩尔消光系数的一种物质，告诉我们一些关于其在不同的波长的光的吸收。详细地说，摩尔消光系数是一个维度中的物质的摩尔浓度为1厘米以上的距离在不同的波长的电磁辐射的吸光度。因此，对应的单位是M -1 cm -1的。 在此计算中的帮助下，它可以用来比较的亮度不同的荧光蛋白。如果我们把摩尔消光系数为5.6万平方米-1厘米-1和量子产率0.6EGFP的例子中，我们得到了一个价值33.6 M -1厘米-1。有时人们谈论的相对亮度的荧光蛋白。在这种情况下的亮度乘以摩尔消光系数与量子产率和绿色荧光蛋白（33.6 M -1厘米-1）的亮度值除以计算。通过这样做，相对亮度转换为众所周知的EGFP的速度稍快，使不同的荧光蛋白的比较 处理大量的荧光显微镜实验观察活细胞。以淬灭等特点，并考虑到漂白，生命细胞成像很明显，是高度依赖于时间。即使在组织学的或固定的细胞样品的情况下，重要的是不要太长的时间和太多的光强度，照射试样。描述感兴趣的抗蚀剂降低其荧光行为的机制的荧光蛋白的能力的参数的耐光性，耐光性被表示为通，直到为初始亮度的50％消失了的秒数。为了进行比较，和最多为10瓦/厘米2的弧光灯提供照明，而高强度的光源，如激光（高达100瓦/厘米2），可能会产生的非线性效应。此外，测量和比较的耐光性，荧光蛋白样品的pH值是标准化，以适于一个典型的哺乳动物细胞的大小的7.0和蛋白质溶液的液滴。相邻的具有上述的光源照明，是连续的。平行辐射产生的光子进行计数。EGFP的情况下，需要174秒的原始亮度的一半褪色（沙纳等，2005）。换言之，排放量减少至1,000至500光子/秒174秒。 了解不同的特点，如激发和发射极大值，亮度，量子产率等有一定的荧光染料或蛋白实验者能够选择不同的候选人或观测条件满足他的要求，具有一定的实验设置。此外，他是能够详细地解释结果，如果他知道照片的物理特性不同的荧光染料或蛋白质。
荧光染料
淬灭和漂白
量子产率
亮度
耐光