尼康显微镜：三色成像激光扫描共聚焦显微镜的方法及应用
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）通常用于产生数字图像的单，双，三荧光标记的样本。使用红色，绿色和蓝色（RGB）颜色的信息用于显示多达三个标记细胞的荧光探针，任何共定位观察到不同的加色的彩色图像时，合并成一个分布单三色图像。
在本节中，我们提出了生产三色共聚焦图像，采用了时下流行的图像处理程序，Adobe公司的Photoshop先前公布的方法的简化版本。此外，多个应用程序的显示共聚焦图像的三色的合并协议进行了讨论。请注意，这些数字化的方法不局限于使用激光扫描共聚焦显微镜的图像，并可以适用于导入到Photoshop中的数字图像，从许多不同的来源。
荧光标记的样本图像使用一个型号Bio-Rad公司MRC-600激光共聚焦扫描系统，收集用人前面描述的方法在文献中。选定的图像共聚焦显微镜微电脑主机转移到另一台计算机的二进制文件。图像被直接导入到Adobe Photoshop中，无论是作为纯二进制文件（RAW）或标签图像文件格式（TIFF）文件。在RAW文件的情况下，共焦图像的实际尺寸必须被输入，例如，一个典型的图像大小为768×512像素，与一个76个字节的头。标题是特定的Bio-Rad公司专有的PIC文件格式，并从不同的公司可能会随成像系统。这种信息的图像文件应免费提供从各焦公司。相比之下，TIFF文件直接导入到Photoshop中打开。如果有必要，共聚焦图像文件可以转换为TIFF文件使用市售的程序设计操纵聚焦的文件或其他软件，如NIH图像，这是在互联网上提供下载。存在的一些方案，共聚焦图像，可用于进一步的处理。
产生三色的图像在Photoshop，粘贴各共聚焦显微镜观察到红色，绿色和蓝色通道的RGB彩色图像的灰度图像。在下面的描述的过程中，包括在Photoshop程序内的各种命令的位置（用斜体表示）后，每一个操作。不同版本的Photoshop可能使用略有不同的命令结构，特定的命令或菜单位置，进行相同的操作。在一个特定版本的具体操作上更多的详细信息可在Photoshop的用户指南。
一旦三个灰度图像在Photoshop中打开，构造一个空白的RGB图像（文件，新建）。图像必须为相同的尺寸和像素的分辨率为原来的三个灰度图像的共聚焦显微镜，在这个例子中，768×512像素和72像素/英寸。可确定的大小和分辨率的图像调整（图像，图像大小）。这种新的RGB图像应该是黑色的，因为在荧光图像的背景通常是非常接近或黑色（黑= 0，白色= 255）。可以选择另一种颜色的背景以美容为目的，但实际划定的图像区域的黑掩模的结构应能够与实际的图像中的信息的新的背景颜色不会干扰。
如果尚未打开，打开“ 通道“调板中应该在这个时候（“ 窗口“，显示频道）。三个灰度图像，现在准备将其粘贴到新创建的RGB图像。这是通过选择*灰度图像（选择所有），并将其复制到新的RGB图像（编辑，复制）所需的红色，绿色或蓝色通道，通过点击在新创建的RGB图像，并用鼠标然后在“ 通道“调板中列所需的通道。例如，对于红色通道，点击红色窗口在列。*后，灰度图像粘贴到RGB图像（编辑，粘贴）。图像现在将出现在“ 通道“调板中列在红色和RGB通道。正在选择的第二和第三灰度图像，复制和粘贴，分别为绿色和蓝色通道的RGB图像，使用相同的例程。这些操作的结果是一个单一的三色合并后的图像（图1（a）和（b）条），这是通过双击在频道调色板列的RGB图像上显示。有从三个原始源图像的位深度的信息没有损失，因为3个8位的图像合并成一个单一的24位图像。的图像显示在图1中的果蝇胚胎分别在三个不同的激发和发射波长，然后将其分配给不同的颜色通道，使用Photoshop产生三色的合并后的图像的两个版本的相同的三个采集图像的创建。
在合并后产生的图像的色彩层次可以改变使用水平（图像，调整，色阶）独立调整红，绿和蓝色值的图像。*后，对于呈报而言，图像的亮度和对比度（图像，调整亮度/对比度）是微调。可以查看和选择图像的微妙变化，利用变化（图像/调整/变化）。在这个时候使用嵌套在Photoshop中的图像处理功能，可以实现很多额外的操作。特别有用的功能允许除了图形和汇编成多屏显示的数字图像。图形其后更方便的编辑，如果他们被粘贴到一个单独的层中的图像，而不是永久地取代实际图像本身的像素。
图像保存到计算机的硬盘，选择另存为（文件，另存为）。TIFF格式的图像通常保存在压缩使用的Lempel-Ziv的韦尔奇（LZW）计划，这是完全损失。联合图像专家组（JPEG）压缩其他的压缩方法，如可以引入文物可能更加复杂，每次被重新存入一个文件。*终图像存档到CD-ROM或DVD-ROM。
彩色硬拷贝的图像可以直接从Photoshop中使用一个高分辨率的数字彩色幻灯片机或数字热升华打印机或其他颜色。这些设备是从Photoshop插件，避免了需要将图像传输到另一个程序尚未直接控制。详细方面的海量存储和编制的硬拷贝已在*近的文献中广泛检讨。单色图像往往缺乏对比上热升华打印机打印时。某种程度上，这个问题可以克服，由生产单一的RGB图像，因为在此之前，调整三个通道的相对水平，因此有资料打印的所有通道（图像，调整，色阶）。
对于合并两个图像，使用这种方法，第三通道空置。早期版本的Photoshop需要使用一个空的或黑色的，用于第三通道的空白背景图像的红色图像的红色通道，绿色图像的绿色通道，在蓝色通道的RGB图像的空白图像以产生一个红/绿双标签图像。使用3.0.5版的Photoshop（或更高版本），可以粘贴到一个新创建的黑色RGB图像灰度图像。例如，要产生一个红/绿图像，单独的图像粘贴到红色和绿色通道（图2（a））。
为清楚地输送收集的生物信息，通过共聚焦显微镜内的三色的合并后的图像的颜色的组合是很重要的。两个*常用的荧光团的真正的发光颜色，若丹明，荧光素，是便利，红色和绿色，分别重叠域的表达是黄色的。这些都是用肉眼观察颜色，配备适当的过滤器套同时双标成像，这是现在大部分的显微镜制造商在传统的落射荧光显微镜。需要注意的是在一个三重标签样品制备的共聚焦分析的第三信道通常在远红外发射，例如菁（Cy5标记），这是方便地显示为数字图像中的蓝色，而往往是极其困难的真正的Cy5的排放可视化的眼睛和不那么容易描绘的数字图像。
使用Photoshop，它是一个相对简单的任务，实验的各种颜色组合成不同的渠道重新排列图像。图1中显示的三色合并图像的两个版本作为参考。的检体是一个果蝇胚上面的蜂窝胚盘阶段，三重标记的三个分割蛋白：毛在绿色（图1（a））或红色（图1（b）），蓝色（图1（a） ，目前已知共有*过20种KLFs的）或绿色（图1（b）），巨红（图1（a））或蓝色（图1（b））。不同版本的实现清理组件不同渠道使用分离通道（“ 窗口“，显示通道，通道面板的下拉菜单中，分离通道）和重组合并通道（通道面板下拉菜单的图像灰度图像的RGB三色图像合并通道，RGB颜色模式）。使用指定频道的输入框，该组件灰度图像可以被分配给不同的信道的RGB图像。因此，颜色并不一定对应的试样的实际颜色。
额外的颜色可以通过将两个版本的相同的图像，所述第二图像中的第三信道合并成两个，三个通道的双标签图像中包括。例如，紫色和绿色的图像所产生的相同的图像粘贴到红色和蓝色通道，得到紫色，并且被放置到所述第二图像的绿色通道（图2（b））。附加的颜色组合是红色和淡蓝色，淡蓝色包括蓝色和绿色通道;或蓝色和黄色的，其中包括红黄色和绿色通道（图2（c））。在此，重叠的表达总是显示为白色的图像中的时间向所有三个通道的重叠信号（图2，（b）和（c）项）。不同的颜色组合表现出这里利用一个果蝇三龄翼成虫盘标本双标无翅，红色，绿色，或蓝色（图2（a）至图2（c）），绿色，紫色achaete，或黄色（图2（a）至图2（c），分别）。这些额外的色彩组合时，可以使用多面板的数字*过三种蛋白质的表达模式的图像显示在单独的面板，让不同的颜色分配给每个蛋白质的几个双标。请注意，细胞核，共表达无翅及achaete的显示在图2（a）和白在图2（b）和图2（c），为黄色。
这种合并共聚焦图像的方法被广泛用于映射双重和三重标记标本中的大分子分布。由于绝妙的特异性免疫荧光法，很多的图像时是相当抽象的视为单一灰度图像，在许多情况下，当第二或第三图像的组织内的公知的地标显示在同一时间只能被解释。这是典型的核标记的荧光原位杂交（FISH）。这些图像通常由相对较少的明亮像素大多是黑色的背景上，只能解释当第二个，复染的形象与明亮的彩色杂交中心的整个细胞核或染色体蔓延收集和合并的图像。污渍如YOYO-1（激发*大值491纳米）或TOTO-3（激发*大值642纳米）的二聚核酸*counterstains为这些目的。近日，已*过三探头定位于同一染色体组合标记策略。在这里，更复杂的计算机图像合并和测量方法已经发展到在影像中显示的生物信息。
多标签的是共焦成像发育生物学家研究细胞谱系的一个，或有时两个分布，蛋白质可以作为地标映射显影组织内的第三感兴趣的蛋白质的克隆和分析一个**的工具。此外，荧光标记的鬼笔环肽是一个方便的探头包括在成像细胞轮廓的三重标签策略。染料的具体组合，例如罗丹明鬼笔环肽标记细胞的轮廓，TOTO-3标签核（Cy5的通道），以及抗体，该抗体的蛋白质的感兴趣（荧光通道）可以用在一个三标签策略映射到细胞核的蛋白质的位置，到细胞质中，或细胞外基质。
除了 显示多达三个不同的大分子在细胞内的相对分布相结合的三幅图像，这种方法可以用来作为一种替代试样内的显示深度信息的三维（3-D ）重建。使用激光扫描共聚焦显微镜，一系列的图像不同的焦平面内的试样收集到一个单一的文件或z系列。这些图像保持从检体的x，y，和z登记，并具有相同的尺寸和像素的分辨率。三幅影像选自这样的z系列，导出为单一图像文件到Photoshop，然后将它们合并和以前一样，使红色，绿色和蓝色的颜色被分配给在不同的深度范围内的试样（图3（结构一个）和（b））。以类似的方式，单个图像可以提炼出三个不同的时间点收集的共聚焦显微镜并结合成一个三色的合并后的图像的随时间推移的电影序列文件。这些文件是z系列的文件类似，不同的是时间已取代z维度。在这里，颜色差异是用来总结的位置结构的变化，随着时间的推移在一个单一的形象。
在图3（a）所示的图像合并三个图像从彩色颜色是编码，使试样中的深度的Z系列投影的结果。上皮细胞核显示为绿色与规模形成在蓝色和红色在不同级别上皮细胞的细胞核。标本是一个整体安装蝴蝶蛹翼上皮细胞用碘化丙啶染色。在图3（b）中，不同的结构在一个双标签图像映射到深度比图3（a）一个整体安装在稍晚的发展阶段的蝴蝶翅膀上皮。细胞核被标记为与TOTO-3，和在更背侧的位置在上皮细胞核的新兴鳞翅与得克萨斯红鬼笔环肽标记。
Photoshop中还可以提供一个进一步的处理的图像文件是兼容的，因为与许多其他程序的桥梁。例如，发展的共聚焦图像序列已使用Photoshop处理，随后转移到市售的变形程序，加工成短动画序列的发展。这些序列可以进一步编辑和编译使用Adobe Premiere视为使用苹果的QuickTime软件，直接在电脑上（以及其他适用的软件可以用来）数字电影，用于演示目的或导出到录像带上。
Photoshop是可用于许多不同的计算机平台，并可以运行在大多数的共聚焦显微镜主机电脑。一些更复杂的共焦成像系统是能够收集，合并和使用三个检测器的系统，该系统能够消除Photoshop的使用，同时上色三个图像。但是，它通常是需要使用额外的实验室微型计算机操作以便腾出共焦工作站，它的主要目的，采集图像的共聚焦图像。此外，用于编译的*后数字，它可能有必要在*终的板从其他来源的图像相结合共聚焦图像，并且在这种情况下，一个单一的图像处理程序，可以用在许多不同的实验室计算机的通用性是非常宝贵的。