徕卡显微镜，FLCS - 荧光相关光谱进展
在单分子水平的表征物质已成为的标准剧目科研院所的一部分。*常用的方法之一，是荧光相关光谱（FCS），它可以用来检查的动态性和在溶液中的荧光分子浓度。本文介绍了一种测量技术，结合了经典的FCS测量与时间相关的单光子计数，以获得更精确和可靠的结果。
FCS是经常被用来研究的分子在溶液中的动态过程。然而，实验因素严重影响的分析，如FCS数据记录。典型的因素包括工件的测量系统中，杂散光的荧光基团的三线态，杂质或背景的样品。由于这些因素不是恒定的，但样本间差别很大，一个FCS实验的分析往往是问题，而且容易出错。因此，*好是根据物理定律，然后再执行一个特定的数据分析来清洁数据记录。
遵循一个明确的数学分布概率的物理值，荧光衰减。这里所描述的方法，荧光寿命相关光谱（FLCS）使用清洁FCS数据集的荧光衰减行为。FLCS可以使用，例如，以消除工件的测量系统或单独的数据记录从一些荧光基团的混合物，然后可以逐个进行分析。这种类型的评估产生明确和可重复性的结果，即使是*小的荧光浓度。
单分子光谱
在七十年代推出的荧光相关光谱的原理描述了在椭球体积溶液中单分子荧光研究。结合共聚焦显微镜，，FCS已成为一个重要的测量方法，为研究分子动力学和浓度。
在一个FCS的实验中，典型的连续的激励光聚焦到一个点在纸巾或溶液。通过使用共聚焦设置时，可以观察到分子内的体积为约0.3毫微微升（图1A）。此卷是由激发和发射波长，客观和共焦针孔的大小。
实验本质上是基于布朗运动的分子扩散通过检测量，很高兴和发光。测量的对象是由此产生的荧光强度随时间的变化（图1B），然而，可能的影响，以及由其他光物理过程。
分析FCS的数据的*个步骤是从测得的荧光强度，计算出的自相关。然后，一个合适的模型函数的变参数装配到所得到的自相关函数（ACF），从其中，例如，所产生的荧光团浓度或扩散常数。ACF进行分析时，所面临的挑战是找到一个合适的模型描述不仅实际性能的荧光，也影响实验因素与可变参数函数。每个额外的影响需要至少一个附加的参数的复杂性和分析的倾向，因此，包含错误增加。如果样品有一个以上的荧光基团，每个荧光团的扩散行为影响所得的ACF，这不是一个简单的线性组合的情况，而是一个复杂的各个信号的叠加。
图 1：插图的FCS实验。（A）测量体积（深蓝色）的聚焦激光束在聚焦。（B）上记录一个FCS数据记录和计算的自相关函数的荧光强度的波动的。
不同的方法
多年来，已经建立了各种版本的FCS来处理的与ACF的分析相关联的问题。所有这些方法的目的是清洁背景工件的数据，并允许同时研究一些荧光的分子。
*常用的方法是荧光互相关光谱法（FCCS），在其中的荧光，同时记录与两个检测器。探测器后脉冲的*常见的实验工件之一，例如，可以消除与FCCS。这是一个的幻像脉冲发生在检测器的反馈所造成的在测量过程中。分配相等的部分所发射的光子在两个检测器上，然后从两个数据记录计算出的互相关的干扰信号被删除。
FCCS还允许具有不同的光谱发射波长的荧光团分离，从而使单独的数据分析用于确定扩散常数和浓度。除此之外，交叉的两个信号的相关性提供了一个潜在的相互作用的分子受调查的信息。然而，实验装置的复杂性，不应该被低估。单独检测的荧光基团的检测量有重叠的100％，这是由于检测音量大小的激发和发射波长的依赖性非同小可。此外，*光谱分离的荧光可以经常不实现，这反过来又使数据记录的分析更加困难。
数学的其他方式的数据分开，实例中的扩散系数的差别的基础上。然而，必须不同的分子的扩散系数（至少）1.6，得到有用的结果的一个因素。因此，这种测量方法并不分子浓度或扩散常数进行简单的阅读，而是基于高度复杂的数学拟合的ACF，包括假设一般不可能通过实验证明，因此极其容易出错。
通过时间相关的单光子测量的改进
荧光寿命相关光谱的方法，可以规避上述问题。FLCS实验中，不仅荧光强度的时间变化，而且还有具体的一个脉冲激发后的荧光基团的荧光衰减行为的测量，然后用于清洗的FCS数据记录。FLCS，而不是假设的测定数据的分析，基于纯数学的评价方法。
基本上，FLCS FCS和时间相关单光子计数（TCSPC），这是*适合的方法，用于测量单个分子的荧光衰减行为的组合。TCSPC需要的脉冲激励激光器和单光子灵敏的检测器。
实验原理
对于FLCS实验，TCSPC测量是在一个特殊的“时间标记的时间分辨”（TTTR）测量模式。在这里，两个相互独立的为每个检测到的光子的时间的测量：首先，在激励脉冲的发病和到达的检测器信号（微观到达时间）以皮秒分辨率，其次从实验开始时的时间之间的时间注册的特定的光子（宏观到达时间）。
的微观的到达时间被用来产生一个的TCSPC直方图，描述了特定的荧光衰减行为。就像在任何经典FCS实验宏观到达时间可以用来计算出的荧光强度随时间的变化，并确定通过计算的ACF的扩散系数和浓度。
对于一个FCS的实验中，荧光团的混合物连续激发，也有一定的概率为每个检测到的单光子发射的荧光团或荧光基团B.这个概率是恒定的时间，因为没有定义的时刻激发。FLCS是基于一个简单的事实脉冲激发产生激发一个特定的时间，这意味着一个光子所发出的荧光基团A或荧光基团乙变化的时候（图2A）的检测概率。检测到的光子激发后不久可能发射的更快的衰减的荧光基团（寿命变短），，而晚光子更有可能被发射的速度较慢的衰减荧光团（更长的寿命）。随时间变化的检测概率的基础上，有数学方法可以应用到统计概率原产概率分配的过滤器，每个光子的到达时间（图2B）。
图 2：（A）两个荧光基团的荧光衰变行为A（红色）和B（蓝色）以及混合物（黑色）。（B）分配给每个光子的到达时间与从荧光团发射的光子的概率统计滤波功能A（红色）或B（蓝色）。
要设置一个合适的分配滤波器，对应的直方图的构成成分是必需的，除了TCSPC测量本身的直方图。如果，例如，人们希望分开的荧光基团，TCSPC直方图纯荧光团是必要的。要删除不带荧光基团的杂散光成分的测量，一个额外的测量是必要的。分布过滤器，然后分配给每个光子的光子的概率来源于特定组件的抵达时间。因此，此数据分离发生在单光子水平。分离的数据记录可以彼此独立地进行分析计算ACF。
这种类型的统计分析不仅适用于所检测的荧光团的排放量，但同样适合用于描述工件的测量系统，例如暗计数率和后脉冲检测器（图3A）。关于这一主题的文学已经包含了成功的例子分裂的测量数据记录到多达4个的子组件。
一般来说，它是重要的，FLCS要注意的是使用分离的和整个荧光衰减行为，可确定从它的平均荧光寿命。可以在数学上彼此分开的荧光基团或组件，如果他们显示在的TCSPC直方图的不同的配置文件。
示例应用
的功能性，有效性和稳定性的FLCS方法已被证明在极其广泛的应用范围，不仅在体外而且在体内。即使在简单的分析只有非常小的荧光染料浓度的FCS的实验中，使用FLCS导致更高的精度和再现性分子浓度和扩散速度的测量。图3示出FLCS测量的染料Atto655，溶解在乙二醇。由于大的杂散光成分在低摩尔的解决方案中，只有约60％的检测到的光子起源从染料，其中所确定的荧光团浓度有负面影响。在比较有和没有生命周期的滤波的数据分析的自相关曲线（图3C），可以看出，通过消除测量的背景，其中包含杂散光系统构件（图3A 和图3B ，红色线），远小的分子数被检测到，构成设定的分子溶液的浓度（下午10点）的良好近似。该方法也被体内的小区的测量，其中FLCS用于去除来自数据记录 在单元格中存在的黄酮类和NADH分子施加巨大的成功。
在法国巴黎狄德罗|bat365，软件下载大学的的实验室Maïté酒店Coppey穆瓦桑*近能够证明，它也有可能在体内 FCCS实验，以除去在与荧光蛋白GFP和mCherry的的mCherry检测通道中的绿色荧光蛋白的光谱串扰。在这里，在GFP激发用脉冲激光和连续波激光的mCherry。这使一种蛋白质相互作用研究的ACF没有数学拟合。
图 3：FLCS实验系统特定的测量工件内的影响和消除。（A）的TCSPC直方图染料的Atto655的溶于乙二醇（黑色）10日下午，在水（100分，蓝）和背景（红色），纯Atto655的。（B）的统计过滤功能分配给每个光子的到达时间的光子来源于荧光团（蓝色）或背景（红）的概率。发射Atto655检测到的光子的概率增加的延迟时间越长。（C）的自相关函数（黑色）和（红色）寿命过滤FCS数据集的记录。
总结
FLCS是一个复杂的方法确定分子的浓度和动力学。由于其物理法，荧光衰减行为，或许可以用一个统计分布的概率，这是很有用的分离的测量数据和清洗工件的FCS数据记录。FLCS从而使分子的浓度和扩散时间更精确和可重复的决心。这反过来又导致生成的数据之间的可比性，不同的测量系统之前，现在这是不可能的。