徕卡显微镜：多波长在荧光显微镜落射照明

荧光是一个过程，其中已吸收的光（光子）后的物质emitts的辐射的波长（颜色），其中长于吸收光，这个排放停止后立即停止激发。这种现象是荧光显微镜及其应用的基本元素。

除此之外，“古典”在光学显微镜下的荧光激发，有可能两个或多个光子具有较长wavengths比发射的激发激光共聚焦扫描显微镜通过现代技术来获得相同的发光效果。

 荧光作为autofluorescenc的生物和/或无机结构或所谓的次级荧光的特殊染料（荧光染料，荧光标记物）的处理后的检体发生。要执行荧光显微镜，必须满足以下要求：**的能量源（高压汞弧灯，卤灯等），选择的激发光发出的辐射**的足够的透射滤光器的系统（filterblocks）的，，*后但并非*不重要的是，适用于荧光，即集电极镜头，照明，分光镜，目标，管镜头和目镜光学零件和服装。

与今天的情况相比，在*次施加透射光场和暗场显微镜的使用荧光显微镜。这是由于其有限的护林员在那些日子里的应用。但随着组织学，细胞学，分子生物学和免疫诊断其重要性日益增加的需求，从根本上改善照明和观测技术来越来越多。这是入射光荧光显微镜诞生的时刻。

在其近40年的应用和发展的过程中，这种技术成为常规和科研工作，在生物学，医学，科学和工业的基本工具之一。入射光荧光显微镜的进步，尤其是由研究工作Ploem的他的功能引领趋势也正向莱茨RESP战略决定。韦茨拉尔徕卡光学仪器发展需要。

这个发展过程中是按时间顺序描述在目前的贡献。à提要荧光显微镜技术使显微镜，目标，荧光染料，光源和过滤系统有关的应用领域，并指这方法的相关信息。

图 1a的：荧光多wavelenghts的落射照明器与四个二色光束分离器安装在一个滑块上，用紫外线入射照明，紫色，蓝色和绿色的激发光的。建在阿姆斯特丹|bat365，软件下载大学（Ploem，1965）。

图 1b中：莱茨原型（没有商业化的）与4个二向色分束器安装在一个滑块（Ploem，1967）的多波长的落射照明。

图 1C：莱茨落射照明器与四个可交换滤光块（块）（卡夫，1972）。

不久与窄带蓝色和绿色的光激发它变得清晰，广泛应用于免疫荧光异硫氰酸酯（FITC）和异硫氰酸四甲（TRITC）标签检测开辟了*佳的可能性。使用的蓝色和绿色的激发也*小化的自体荧光的组织成分，与传统的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC现在可以兴奋与窄带蓝色光（使用滤除带外干扰的半宽度为16nm），在490 nm处（长波长蓝色）的*大激发，清楚地观察到绿色荧光发射峰在520纳米。*小化组织成分的自体荧光（图2a和b），在一个高的图像对比度。激发FITC接近其*大激发启用，即使是高压汞弧灯，有没有强烈的排放峰值在蓝色波长范围内，可以用这样一个高效的激励。此外，落射照明用的*次启动，激发富尔根副蔷薇苯胺的强汞（图3a和b）在546 nm处的发射谱线的绿色反射分色镜。

图 2A：照亮宽波段紫外线激发与immunolabel（FITC）标记的组织细胞。注意蓝色自发荧光的组织结构。

图 2B：相同的组织和相同的免疫染色FITC标记落射照明使用窄带蓝色（490 nm）的光照亮。请注意，增加图像的对比度（Ploem，1967）。

图 3A：肝组织。细胞核染色进行DNA Feulgen反应pararosanilin的，可视化与传输绿灯。这污点被称为吸收污渍，不知道是荧光。在晶核上亮起，导致事件窄带绿光（546 nm）的红色荧光。

图 3B：肝组织。核Feulgen反应副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明与窄带绿光（546纳米）和二色分光镜反射绿灯。大概显微镜用绿光激发（Ploem，1965）的*个例子。注意：大的图像对比度。

在他的第二次出版的多波长落射照明器，描述一个的莱茨原型与四分色光束spittters（图1b），Ploem 承认布伦伯格和Krylova的贡献[ 2 ]。俄罗斯在这一段时间的研究，没有任何主要的工业发展在俄罗斯或东德落射荧光显微镜的交通不便是莱茨没有意识到这样的发展早的原因。引进外延照明，紫外线，虽然有用的几个应用程序，没有被莱茨一个新的技术发展的动机，因为他们已经出色的传输暗场紫外光激发的可能性。增加世界广泛使用的常规荧光显微镜在医疗诊断和分子生物学研究，然而，利润落射照明使用窄带激发新的可能性，用蓝色和绿色的光。由于可以使用标准的高压汞弧灯，这似乎是一个实际的建议。

随后，徕兹分别紫外线，紫色，蓝色和绿色的光[ 13 ] 开发了一种新颖多波长荧光epiilluminator的四个旋转分色分光镜（徕兹PLOEMOPAK） 。莱茨照明（包含四个分色分光镜）屏障过滤器和旋转炮塔激发滤光片在连续几代增加了。*后一个优雅的落射照明，构建了卡夫[ 15 ]含有多组的激发滤光器，二向色分束器和一个阻挡或发射滤波器的组合，一起安装在过滤器中的多维数据集，也称为过滤器块（图4）。由于此照明灯迅速变成光路允许过滤立方体，多波长照明同款组织成为一个实用的命题。此外，四个过滤器的照明器中的多维数据集可被交换由用户（图1c）。两套不同的四个滤光块进行组装，选择从许多滤光块，包含组合的激发，阻隔过滤和分色分束器，为不同的应用程序开发。经过建议Ploem，利时也产生了一个倒置的显微镜落射照明（图5a和b）。多波长荧光显微镜的的莱茨PLOEMOPAK照明的审查，被称为读者评论普卢塔

左：图。4：完成莱茨（徕卡）过滤器的立方体（块）含有荧光显微镜：激发滤光片，分色分束器和发射滤波器（垒）。

图 5A：徕卡倒置荧光显微镜，多波长落射照明。

图 5B：寺崎^®塑料托盘与人类淋巴细胞移植研究后荧光细胞毒性试验。倒置显微镜落射照明。

徕兹（徕卡）滤波器立方体系统是如此的高效，现在，39年后，相似类型的过滤器立方体仍然使用多波长荧光显微镜*显微镜制造商。这种发展*终导致在徕卡的发展，自动化的多波长荧光落射照明器，可容纳8个滤光块不同的波长范围（图5c）。当过滤立方体，电脑显示器上的像素移位避免或保持在低于35 mm胶片由于0像素移位技术的分辨能力之间切换。此照明灯是现在使用的荧光原位杂交方法（FISH）染色体的研究。

Ploem [ 24，25，26，27，28 ]，范德Ploeg Ploem的[ 20 ]和奈恩和Ploem [ 18 ]进一步探索过滤器的组合，许多医学领域的应用也得到了发展。这样做是与肖特和Leitz合作。Rygaard和奥尔森等人[ 35 ]开发了一种新型的短波通高传输干扰滤波器具有非常高的传输和尖锐切断对波长大于490纳米的蓝色光。

Ploem [ 23 ]结合SP滤波器与1毫米GG 455过滤器，阻止紫外线激发，肖特和建议的绿色光激发和激发一个过滤器Balzers公司开发的类似的过滤器（SP 560 = KP 560）紫光（LP 425 = KP 425）。后者过滤器适用于神经递质[ 25 ] 调查。在图6a和b中得到的蓝色荧光可以观察到。

图 5C：徕兹（徕卡）机动落射照明器与八个滤光块（块）。

图 6a的蓝色荧光肾上腺素（加利福尼亚州）的神经丛和黄色荧光肥大细胞（5-HT）所包围的小血管的大鼠肠系膜。甲醛诱导的神经递质的CA和5-HT的荧光基团的荧光。

图 6B：相同的组织和染色图。6A：EPI-窄带紫色激发光照明（LP 3毫米GG 400和SP（KP）425干扰过滤器），分色分束器495纳米，反映了紫光和屏障过滤器LP 460纳米。该过滤器立方体permittted的*次观察蓝色荧光肾上腺素能神经纤维，明显不同的从黄色荧光肥大细胞（Ploem，1971）

从眼镜行业方面，早对这些发展中的贡献和评论写卡夫[ 14 ]，沃尔特·[ 39，40 ]，特拉普[ 38 ]和赫尔佐格[ 8 ]。

落射荧光显微镜中使用的过滤器中定义的主类（一）主要激发滤光片LP（长传）和SP（短传） -德国文学被称为KP过滤-及（b）二级过滤器作为屏障过滤器和发射滤波器等[ 23 ]。后者也被称为荧光选择过滤器，例如用于限制FITC荧光峰值在520 nm处观察到这些。荧光显微镜的过滤器已被赋予由赖希曼[ 33 ] *近的一项广泛的审查。

Cormane [ 3 ]首次证明，窄带蓝色光落射荧光标记FITC免疫人体皮肤疾病的研究中得到*佳的对比度。透射光激发紫外线灯，用来引起如此强烈的自体荧光在皮肤的弹性纤维，使可视化荧光抗体严重阻碍。

在七十年代的开创性工作莱茨落射荧光显微镜恰逢一个世界性的增加免疫和其他分子生物学方法，像鱼在医学诊断和研究中的应用。hijmans等。[ 9，10 ]首次证明莱茨新的多波长激发落射照明的实用性，对于某些类别的免疫球蛋白细胞的选择性检测，使用绿色荧光FITC和红色荧光TRITC抗体共轭。他们应用的两个波长的激发方法，使用蓝色和绿色的光的选择由一个发射滤光器在520nm处（图7）的FITC荧光峰值。brandtzaeg [ 1 ]和Klein等。[ 12 ]有类似的发现，识别免疫重要的细胞类型，使用双波长激发莱茨epiilluminator的。在染色血“玫瑰花结”的形成，使用UV和绿色的光的两个波长的激发方法，可以显示红细胞周围的单核细胞（图8）

图 7：骨髓细胞的抗-κB的TRITC共轭的抗-IgG FITC共轭染色。的EPI-illmination窄带绿色和蓝色光，导致TRITC和绿色荧光的细胞含有FITC标记的细胞中含有的红色荧光。一些细胞中含有FITC和TRITC。

图 8：人体血液细胞，“花环”的形成。蓝色荧光染色芪使用外延照明用紫外光红细胞染色。淋巴细胞激发后的绿色光（1965）与橙红色的染色曙红染色。